Nata negli Stati Uniti (Monroeville, Alabama) il 28 aprile 1926, era la più giovane di quattro fratelli. Studiò legge all'Università dell'Alabama dal 1945 al 1949 e frequentò corsi alla Oxford University. Nel 1950 lavorò a New York come impiegata addetta alla prenotazione dei posti di due compagnie aeree. Nel 1959 accompagnò l'amico scrittore Truman Capote in Kansas come assistente per le ricerche relative a un romanzo che poi divenne A sangue freddo; fu Capote, di cui era amica fin dall'infanzia, a consigliarle di pubblicare i suoi racconti.

È famosa per il suo primo romanzo, pubblicato nel 1960 con il titolo originale To Kill a Mockingbird (tradotto in italiano come Il buio oltre la siepe), che le valse un immediato ed eccezionale successo di pubblico e il premio Pulitzer per la narrativa. Dal libro fu tratto nel 1962 il film omonimo, che contribuì ulteriormente alla diffusione e al riconoscimento dell'opera. 

Per lunghi decenni Lee pubblicò un solo romanzo, e la sua scelta di vivere fuori dai riflettori alimentò il mito della «scrittrice di un solo libro». Tuttavia, nel 2015 venne pubblicato un secondo volume intitolato Go Set a Watchman (in italiano Va', metti una sentinella), tratto da un manoscritto ritrovato e scritto in origine prima di To Kill a Mockingbird; l'uscita, avvenuta il 14 luglio 2015, suscitò molto interesse ma anche polemiche, perché alcuni si chiesero se l'autrice anziana fosse stata pienamente in grado di dare il consenso alla pubblicazione. Le autorità dell'Alabama aprirono un'inchiesta a titolo precauzionale per verificare eventuali abusi o pressioni legati alla pubblicazione; le indagini, condotte da agenzie statali, furono poi chiuse senza che emergessero prove di abuso o sfruttamento. 

Nelle sue ultime stagioni di vita Harper Lee visse a Monroeville; morì nella sua casa il 19 febbraio 2016, all'età di 89 anni.
Recentemente è stato pubblicato un libro con i suoi racconti e articoli giovanili, La terra del dolce domani.